هناك تقريبًا جميع الشركات التي باعتمسحوق انزيم البروميلينمخلوط مع غراء. من الصعب تنقية البروميلين إلى 5 000 GDU / جم. ولكن من السهل جدًا تنقية غراء إلى 1 000 ، 000GDU / جم. حتى 2000000GDU / g. لكن وظائف البروميلين تختلف عن غراء. يتناقض اللون ، والطلب ، والذوبان في الماء ، والطعم مع المنتج المزيف والمنتج الحقيقي. هم فرق مسحوق إنزيم البروميلين الصحيح رمادي ، عديم الرائحة ، لا طعم له وغير قابل للذوبان في الماء.
لكن البروميلين الكاذب يحتوي على الميزات التالية:
● إنه أصفر فاتح ، عطري وحلو خفيف ، وقابل للذوبان في الماء. إنها خاصية غراء.
● يستخدم لتقليل الالتهاب وتسكين الآلام. ولكن لا توجد هذه الوظائف تقريبًا في غراء.
● يتم استخدامه كمكمل غذائي فقط ، وليس كمضافات غذائية ، ولكن في الواقع يمكن أن يكون من الدرجة الصيدلانية. لكن غراء يستخدم فقط كمسحوق مغرض للحوم ومستحضرات تجميل.
اختبرنا البروميلين وفقًا لطريقة SDS-PAGE gel و GELATIN DIGESTION UNIT ANALYTICAL و HPLC ، وهناك جزيئات مستهدفة أقل في طريقة SDS-PAGE gel للمنتج المزيف.
فيما يلي نتائج الفصل الكهربائي لصفحة SDS
توضح البقعة أعلاه أن المنتج الصحيح فقط له نفس البقعة في المكان الصحيح في الصورة ، لكن المنتج المزيف به القليل من البقع ، وهذا يعني أن الوزن الجزيئي بالكاد مرئي.
يبلغ الوزن الجزيئي للبروميلين حوالي 33000 ، لكن الوزن الجزيئي للغراء هو 21000. و HPLC Chromatogram:
سترى أن المستخلص الصحيح فقط يحتوي على الأوزان الجزيئية الصحيحة للبروميلين ويمكن اكتشافه بواسطة HPLC.
ولكن إذا اختبرنا فقط الطريقة التحليلية لوحدة هضم الجيلاتين (GDU) ، انظر الملحق الثاني. كل من المنتج الصحيح والمنتج الخاطئ لهما نفس النتائج على النحو التالي:
ساق الأناناس رخيص جدًا ، والمعدل من الساق إلى البروميلين منخفض جدًا ، وهناك بعض التلوث في عملية التصنيع.
تقريبا كل مصنع مسحوق إنزيم البروميلين قريب من الميدان. يستخدمون جذعًا جديدًا. من المستحيل شحن الجذع لمسافات طويلة. يجب التعامل مع المواد الخام في أسرع وقت ممكن عند جمعها من الحقل أو يجب تخزينها في بيئة درجة حرارة منخفضة (4-8 درجة) لتجنب تدهور البروتين. في الحياة الواقعية ، لا تستطيع الشركة المصنعة في الواقع تلبية أي من الشرطين المذكورين أعلاه نظرًا لوجود عدد كبير جدًا من الأناناس. الطريقة المعقولة هي الموازنة بين التعامل مع الوقت وفقدان نشاط البروتين. عادة يتم تصنيع المواد الخام الخام في موسم حصاد الأناناس ، وتخزين المواد الخام الخام في بيئة منخفضة الحرارة (4-8 درجة).
نجري بعض الاختبارات حول الفصل الكهربائي لصفحة SDS ، نظريًا يمكننا رفعه إلى 10 أو 000 أو 20 000. ولكنه سيكون مكلفًا للغاية. 5000GDU / g وجعله مستقرًا ربما على دعم malto / كبسولة دقيقة واحدة أو شيء بالإضافة إلى استخراج / تنقية من الدرجة العضوية.
المرفق الأول
● الطريقة الخامسة SDS polyacrylamide electrophoresis (SDS-PAGE)
SDS-PAGE عبارة عن طريقة رحلان كهربي بهلام بولي أكريلاميد مشوه. يعتمد مبدأ فصل البروتين في هذه الطريقة على حقيقة أن معظم البروتينات يمكن أن تتحد مع سلفات الصوديوم دوديسيل الصوديوم (SDS) في نسبة وزن لتكوين مركب.
تتجاوز الشحنة السالبة التي تحملها جزيئات البروتين بكثير الشحنة الصافية لجزيئات البروتين الطبيعي ، مما يلغي تأثير الشحن لجزيئات البروتين المختلفة ويفصل البروتينات وفقًا لحجمها الجزيئي.
تستخدم هذه الطريقة في التحديد النوعي والتحكم في النقاء والشوائب والتقدير الكمي للبروتينات.
1 جهاز الصك
جهد ثابت أو مصدر طاقة تيار مستمر ، خزان رحلان كهربائي للوحة عمودية ، وقوالب صنع المواد اللاصقة.
2. الكواشف
(1) الماء.
(2) محلول جل الفصل (4x ، محلول أ) 1.5 مول / لتر ثلاثي هيدروكسي ميثيل أمينوميثان محلول حمض الهيدروكلوريك. يزن 18.15 جرام من ثلاثي هيدروكسي ميثيل أمينوميثان ويذوب بكمية مناسبة من الماء. اضبط قيمة الأس الهيدروجيني إلى 88 باستخدام حمض الهيدروكلوريك وخففه إلى 100 مل بالماء.
(3) تزن 58. 0 جم من الأكريلاميد و 20 جم من N ، N '- ميثيلين بيساكرلميد في محلول أكريلاميد بنسبة 30 بالمائة (محلول B) ، يذوب في ماء دافئ ويخفف إلى 200 مل ، يُرشح بورق الترشيح (مخزن في مظلم).
(4) تزن 10 جرام من كبريتات دوديسيل الصوديوم في 10 بالمائة من محلول SDS (محلول C) ، وتذوب في الماء ، وتخفف إلى 100 مل
(5) كاشف تسويق محلول رباعي ميثيل إيثيلين أمين (TEMED ، محلول D).
10 في المائة من محلول بيرسلفات الأمونيوم (محلول E) يزن 10 جرام من بيرسلفات الأمونيوم ويذوب في الماء ويخفف إلى 100 مل. يوصى بإعداده قبل استخدامه أو تخزينه بشكل منفصل بدرجة -20 لمدة أسبوعين.
(7) عازلة مطاطية مركزة (4 × محلول F) 0. 5 مول / لتر ثلاثي هيدروكسي ميثيل أمين ميثان محلول حمض الهيدروكلوريك ، يزن 6.05 جم من ثلاثي هيدروكسي ميثيل أمين ميثان ، أضف كمية مناسبة من الماء ليذوب ، اضبط قيمة الأس الهيدروجيني إلى 6.8 باستخدام الهيدروكلوريك يخفف بالماء حتى 100 مل.
(8) محلول قطب كهربائي (10 ×) يزن 30 جم من ثلاثي ميثيل أمين الميثان ، و 144 جم من الجلايسين ، و 10 جم من كبريتات دوديسيل الصوديوم ، ويتم إذابتها في الماء وتخفيفها إلى حوالي 800 مل. ضبط قيمة الرقم الهيدروجيني إلى 8. 1-8 .8 مع حمض الهيدروكلوريك ، وخفف إلى 1000 مل بالماء.
(9) محلول عينة غير مختزل (4 ×) يزن 3 0 3 جم من ثلاثي ميثيل أمين الميثان ، 20 مجم من البروموفينول الأزرق ، و 8.0 جم من كبريتات دوديسيل الصوديوم ، قم بقياس 40 مل من الجلسرين ، يذوب في الماء ويخفف إلى حوالي 80 مل. اضبط الرقم الهيدروجيني إلى 68 باستخدام حمض الهيدروكلوريك ، وخففه إلى 100 مل بالماء.
(8) محلول قطب كهربائي (10 ×) يزن 30 جم من ثلاثي ميثيل أمين الميثان ، و 144 جم من الجلايسين ، و 10 جم من كبريتات دوديسيل الصوديوم ، ويذوب في الماء ويخفف إلى حوالي 800 مل. اضبط قيمة DH على 81-88 بحمض الهيدروكلوريك ، وخفف إلى 1000 مل بالماء
(9) محلول عينة غير مخفض (4 ×) يزن 3.03 جم من ثلاثي ميثيل أمين الميثان ، 20 مجم من البروموفينول الأزرق ، و 80 جم من كبريتات دوديسيل الصوديوم ، قم بقياس 40 مل من الجلسرين ، يذوب في الماء ، ويخفف إلى حوالي 80 مل. اضبط الأس الهيدروجيني إلى 6.8 باستخدام حمض الهيدروكلوريك ، وخففه إلى 100 مل بالماء.
(1 0) تقليل المخزن المؤقت لمواد الاختبار (4 ×) يزن 3.03 جم من ثلاثي ميثيل أمين الميثان ، و 20 مجم من البروموفينول الأزرق ، و 80 جم من كبريتات دوديسيل الصوديوم ، وقياس 40 مل من الجلسرين ، ويذوب ويخفف بالماء إلى حوالي 80 مل ، ويضاف - 20 مل ميركابتوإيثانول ، اضبط درجة الحموضة إلى 6.8 باستخدام حمض الهيدروكلوريك ، خفف بالماء إلى 100 مل (أو 3.03 جم من تريميثيل أمينوميثان ، 20 ملجم من أزرق بروموفينول ، 8.0 جم من كبريتات دوديسيل الصوديوم ، قم بقياس 40 مل من الجلسرين ، ثم قم بإذابه في الماء وخففه حتى 80 مل ، اضبط الأس الهيدروجيني إلى 6.8 باستخدام حمض الهيدروكلوريك ، ثم خفف بالماء إلى 100 مل ، وقبل الاستخدام ، أضف ديثيوثريتول إلى 100 مليمول / لتر).
● الملحق الثاني
طريقة تحليل وحدة هضم الجيلاتين (GDU)
الغرض: يستخدم هذا الإجراء لتحديد نشاط التحلل البروتيني لمسحوق إنزيم البروميلين.
المعدات:
1. مقياس درجة الحموضة
2. حمام ماء بدرجة حرارة ثابتة عند 45. 0 درجة ± 0. 1 درجة
3. الميزان التحليلي
4. القوارير الحجمية
5. الماصات الحجمية
6. الموقت
7. المسح الرقمي (دقة تبلغ 0. 1 مل)
8. غطاء الدخان
9. ماصات تلقائية
ج. احتياطات السلامة:
يجب إجراء هذا الاختبار في غطاء الدخان.
1. استخدام ممارسات السلامة المختبرية القياسية.
2. الفورمالديهايد: قم بإعداد غطاء الدخان واحتفظ به في جميع الأوقات. معروف بأنه مادة مسرطنة وماسخة.
3. البيروكسيد: مؤكسد قوي
دال - الكواشف ومستحضرات الكواشف:
1. الماء المقطر: حوالي 5 0 0 مل: اضبط درجة حموضة 4.5 مع 0.1 نيوتن هيدروكلوريد.
2. ركيزة الجيلاتين:
أ. ذوبي 25 جرامًا من الجيلاتين (Mikrobiologie. 1.04070) في 375 مل من الماء الساخن ، واتركيه حتى يغلي. بارد حتى 45 درجة.
ب. اضبط الأس الهيدروجيني إلى 4.5 باستخدام 0. 1 N HCI وخفف إلى 500 مل pH 4.5 من الماء المقطر.
ج. حافظ على ركيزة الجيلاتين عند 45 درجة.
3. حل عازلة:
أ. أضف 15 جم من كلوريد الصوديوم ببطء إلى 40-50 مل من الماء في دورق سعة 150 مل وحركه حتى يذوب.
ب. أضف 0 .570 مل حمض الخليك.
ج. اضبط الأس الهيدروجيني إلى 4.5 باستخدام 0. 2N HCL (سيكون الحجم أكبر من 100 مل.)
4. 3 بالمائة بيروكسيد الهيدروجين:
أ. ماصة 2.5 مل من 30 في المائة من بيروكسيد الهيدروجين (محلول مخزون) في دورق حجمي 25 مل ويخفف إلى الحجم باستخدام درجة الحموضة 4.5 ماء مقطر
5. 37 بالمائة فورمالديهايد pH 9. 0: أ. اضبط حجمًا كافيًا (1 0 0 مل) من الفورمالديهايد إلى 9.0 درجة حموضة مع 0.1 N هيدروكسيد الصوديوم (حوالي 20 مل من الفورمالديهايد لكل عينة قبل تعديل درجة الحموضة).
الطريقة التحليلية لوحدة هضم الجيلاتين (GDU) - تابع.
6. 0. 1 0 0 N NaOH: (تم شراؤه قياسيًا) أ. حل المخزون: موحد عند 0.100 نيوتن
هاء - الإجراء:
1. تحضير الانزيم:
أ. حساب تحضير الانزيم
الوزن {{0}} / النشاط المستهدف (حوالي 0.05 جم أو 50 مجم)
أ. وزن الإنزيم بدقة في دورق حجمي سعة 50 مل
ب. أضف 8.3 مل من محلول عازل.
ب. اتركه لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
خفف إلى 50 مل باستخدام ماء مقطر بدرجة حموضة 4.5 ، أضف قضيبًا صغيرًا وحركه لمدة 10 إلى 15 دقيقة إضافية
2. إجراء إنزيم:
أ. ماصة 25 مل من ركيزة الجيلاتين في كل من كوبين سعة 100 مل يحتويان على قضبان تحريك ووضعها في حمام مائي بدرجة 45 لمدة 5 دقائق ، أحدهما لمحلول الاختبار والآخر للمحلول الفارغ.
ب. حل الاختبار:
1) أضف 1. 0 مل من محلول مسحوق إنزيم البروميلين في الدورق المخصص لمحلول الاختبار ، ابدأ التوقيت ودوامة.
2) بعد دقيقتين 0 بالضبط من الحضانة عند 45 درجة ، أضف 0.1 مل من 3 في المائة من بيروكسيد الهيدروجين ودوامة.
3) احتضان لمدة 5 دقائق إضافية.
4) أخرج الكأس من حمام الماء مع التحريك المستمر أدخل مسبار الأس الهيدروجيني.
5) سجل الأس الهيدروجيني بعد 10 ثوانٍ (الرقم الهيدروجيني الأولي)
6) ضبط على الرقم الهيدروجيني 6. 0 مع 0. 1 N هيدروكسيد الصوديوم. (حوالي 2-4 مل)
* ملاحظة: عند ضبط الأس الهيدروجيني إلى 6. 0 توخ الحذر عند الرقم الهيدروجيني 5.8 ؛ يزداد الأس الهيدروجيني ببطء وستؤدي الإضافات الدقيقة من هيدروكسيد الصوديوم عند هذه النقطة إلى زيادة الرقم الهيدروجيني بشكل كبير.
7) استمرار التحريك المستمر ، أضف 1 0 مل من 37 بالمائة فورمالديهايد pH 9.0.
8) سجل الأس الهيدروجيني بعد 10 ثوانٍ ودقيقة واحدة.
9) عاير حتى الرقم الهيدروجيني 9. 0 باستخدام 0. 1 نيوتن هيدروكسيد الصوديوم.
10) سجل حجم المعايرة.
هذا هو عيار الاختبار ، T. ج.
حل فارغ: يجب تشغيل الحل الفارغ بالتزامن مع حل الاختبار. يتم تحقيق ذلك عن طريق بدء تحديد الحل الفارغ بعد 12 دقيقة من بدء حل الاختبار. يمنحك ذلك الوقت لإكمال الاختبار على حل الاختبار قبل الاضطرار إلى متابعة الحل الفارغ. 1) أضف 0. 1 مل من 3٪ بيروكسيد الهيدروجين إلى الدورق المخصص للمحلول الفارغ ودوامة.
2) بعد دقيقتين 0 بالضبط من الحضانة عند 45 درجة أضف 1.0 مل من محلول البروميلين ودوامة.
3) احتضان لمدة 5 دقائق إضافية.
طريقة تحليل وحدة الهضم الجيلاتينية (GDU) - تابع.
4) أخرج الكأس من حمام الماء مع التحريك المستمر أدخل مسبار الأس الهيدروجيني.
5) سجل الأس الهيدروجيني بعد 10 ثوانٍ (الرقم الهيدروجيني الأولي)
6) ضبط على الرقم الهيدروجيني 6. 0 مع 0. 1 N هيدروكسيد الصوديوم. (حوالي 2-4 مل) * انظر الملاحظة أعلاه.
7) استمرار التحريك المستمر ، أضف 1 0 مل من 37 بالمائة فورمالديهايد pH 9.0.
8) سجل الأس الهيدروجيني بعد 10 ثوانٍ ودقيقة واحدة.
9) عاير حتى الرقم الهيدروجيني 9. 0 باستخدام 0. 1 نيوتن هيدروكسيد الصوديوم.
10) سجل حجم المعايرة. هذا هو العيار الفارغ ، ب.
و. الحساب:
1. التعريف: وحدة هضم الجيلاتين هي تلك الكمية من الإنزيم التي ستحرر ، بعد 20 دقيقة من الهضم عند 45 درجة ، 1 مجم من النيتروجين الأميني من محلول الجيلاتين القياسي عند درجة الحموضة 4.5 أو الرقم الهيدروجيني 5.5 (GDU pH 4.5 أو pH 5.5).
GDU / g {{0}} (TB) x 14 x N x 5 0 Wt (g) حيث: T=اختبار العيار (ml 0. 1 N هيدروكسيد الصوديوم) ب=عيار فارغ (ml 0.1 N NaOH) N=طبيعية NaOH (على سبيل المثال 0.100) Wt (g)=الوزن الأولي للإنزيم
معلمات الاختبار:
1. تُخفف مستحضرات الإنزيم إلى تركيز يبلغ تقريبًا 0 001 جم / مل (1 مجم / مل) أو بمسحوق إنزيم البروميلين المركز تقريبًا 1-2 GDU / مل. يتم تقييم المادة المرجعية مع كل عملية تشغيل لضمان دقة الطريقة.
توفر Guanjie مسحوق البروميلين السائب ، باستخدام طريقة اختبار GDU. تعمل عملية الإنتاج لدينا في إطار ورش عمل قياسية CGMP ، باستخدام ثلاثة خطوط إنتاج عبر مصنعين ، ومختبرين مستقلين. لأية استفسارات بخصوص منتجاتنا ، يرجى الاتصال بنا علىinfo@gybiotech.com.
